文章编号:1001-764X(2009)01-0040-03中图分类号:R4465文献标识码:A

用16Sr RNA序列分析技术检测龈下菌斑中致病菌

符义富*,傅尧",李兵",游丽萍*,曾以周",周炳荣°,杨卫东°

(南京市口腔医院a检验科, b外科, c内科,南京210008)

摘要:目的建立牙周致病菌的 16SRNA序列分析方法,检测龈下菌斑菌群的分布。万法、一对 3/0例P用t的忠菌(P)伙放组306例、儿童组70例)龈下菌斑,采用Chelex-100法提取细菌DNA,16SRNA序列分析技术检测牙龈吓啉单胞菌(Pg).伴放线嗜血杆菌(Aa)福赛斯坦纳菌（Tf)、具核梭杆菌(Fn)中间普氏菌(Pi)等5种牙周炎相关致病菌。结果376例牙周病患者龈下菌斑中5种牙周炎相关致病菌CR法与培养法检出率分别为Pg(40 96%，17.82%)、Aa ( 19 15%,9.31%)、Tf(88.56%,27.66%）、Fn(81.91%,23.67%)、Pi(57.98%,19.15%);除Aa外前者检出率明显高于后者(P<Q 01)。结论16SRNA序列分析法具有检出率高,稳定性好以及高度的特异性和敏感性,是一种比较适合临床应用的牙周菌斑检测方法。

关键词:16SRNA序列;牙周致病菌;厌氧菌;洁悠神长效抗菌材料

口腔与呼吸道消化道相通,有厌氧菌和需氧菌混合寄生,牙及牙周组织的特殊解剖结构有利于细菌生长繁殖,导致感染发生。流行病学研究显示，20%~50%的牙周致病菌为螺旋菌"。龈下菌斑中的微生物及其代谢产物是引发牙周炎的始动因子。主要的牙周致病菌包括牙龈吓啉单胞菌(Prophrom onas g ing ivalis ,Pg)、伴放线嗜血杆菌(A ctin obacillus actinam ycetam cam itans,Aa)、福赛斯坦纳菌(Tannerella forsythia，Tf)、具核酸杆菌（Fusobacterin nuclea tum , Fn)、中间普氏菌(Prevotella in tem edia , Pi)5种。在以往的牙周病原菌的研究中,由于分离鉴定比较困难,这些病菌很长时间一直难以检测。本研究用16SRNA序列分析技术检测牙周病患者龈下菌斑细菌的变化,了解龈下菌斑中致病菌群分布趋势 ,为临床防治感染提供参考。

1材料与方法

11临床资料2005年5月一2007年8月在本院门诊治疗的经本院牙周科医师确诊为慢性牙周炎(CP) ,均愿接受洁悠神物理抗菌喷雾敷料治疗的患者376例,分为2组:成年组:306例,男性152例,女性154例,年龄35～60岁;儿童组:70例,男性36例,女性34例 ,年龄7～12岁。

1 2主要试剂及设备GENbox anaer REF124厌氧培养箱(法国梅里埃公司),REF124厌氧产气袋(批号:24B05-12)、REF 96 118厌氧指示器(批号:08904B) 、RTF厌氧标本收集管购自德国Merck

KGaA公司, BSK培养基(英国Oxoid公司),标准菌株Pg(A TCC 33277)、Aa(A TCC 29523)、Tf(A TCC43037)、Fn(ATCC 25586)、Pi(A TCC 25611)购自美国Sciencell公司, Chelex-100 ( Sigma公司)， PCR试剂盒﹑蛋白酶K液(上海生工公司)，PCR扩增仪(PTC-200) ,紫外分光光度仪(Genequant po公司).13标本采集﹑龈下菌斑标本均由本院牙周科医师收集。先用无菌生理盐水冲洗每例患者的病变位点3遍,再用无菌龈上.下刮治器取牙齿上的菌斑,1份立即放入灭菌后的RTF肉汤培养管中,加用无菌液体石蜡封闭;1份放入无菌Eppendbrf管中,- 70℃保存。14细菌培养和鉴定﹑在严格持续的厌氧环境下，将RTF管中标本用振荡器混匀30 s,以肉汤增菌液稀释,选择稀释度为10°的浓度,接种至加有1 3gL琼脂制成的BSK平板培养基中,培养基置厌氧培养箱内33~35℃培养1周(BSK平板培养基在使用前于95%N,5%H环境中预还原24~48 h).根据菌落特征挑选单个菌落涂片作革兰染色和初步生化鉴定:Pg为革兰阴性无芽胞球杆菌,表面有纤毛,黑色菌落,触酶试验阴性,呵哚试验阳性,七叶苷试验阴性,不发酵葡萄糖﹑蔗糖﹑乳糖和纤维二糖;Aa为革兰阴性短杆菌,雪茄烟状菌落,过氧化氢酶试验阴性,分解葡萄糖﹑木糖产酸不产气,还原硝酸盐;Tf为革兰阴性梭形类杆菌,粉红色或黑色斑点状菌落,触酶试验阴性,呵噪试验阴性,七叶苷试验阳性,不发酵葡萄糖;Fn为革兰阴性无芽胞梭形杆菌,边缘不齐的半透明菌落,触酶试验阴性,呵哚试验阳性,苏氨酸产丙酸盐试验阳性,葡萄糖﹑果糖弱发酵反应;Pi为革兰阴性杆菌,溶血菌落,触酶试验阳性,呵吸试验阳性 ,发酵葡萄糖蔗糖,不发酵纤维二糖乳糖。

1. 5引物设计与合成5种牙周致病菌的16SRNA特异性引物序列设计参照文献121,上、下游引物的核苷酸序列5'→3'、PCR扩增片段长度和退火温度分别是:龈下菌斑中牙龈吓啉单胞菌(Pg)TGTAGA TGACTGA TGGTGAAAACC和ACGTCA TC-CACACCTrCCTc31、131 bp.58℃;伴放线嗜血杆菌(Aa)GCTAA TA CCGCGTAGAGTCGT和ATTICA-CACCTCACTTAAAGGT3l、235 bp、59. 5℃;福赛斯坦纳菌（Tf)GICGGACTAA TACCTCA TAAAACA和TcGCCCATTGACCAATA TT''、419 bp.59.5℃;具核梭杆菌（Fn)GGCCA CAAGGGGACTGA GACA和TTTA GCCGICACTICTICTGTTGG1、185 bp.59 5 ℃;中间普氏菌(Pi) GTGCTTGCACA TTCTGGACGTCGAC和CGTCTGCAA TTCAAGCCCGGGYAAG1、367 bp、57 ℃.

1. 6细菌DNA的提取及PCR的方法参照文献6,在含有牙周致病菌斑块的印p管中加入20mg/m l蛋白酶K液4ul和5%Chelex-100液150ul,振荡10 m in混匀,取上清液– 20℃保存。PCR总反应体系为22uE: DNA模板（2u) , 1. 5 mmolLMgC (1 ul) ,缓冲液(2u D) , 10 mmol/u l dNTP(0. 4μI)，10 pmol/u1引物 P1、P2各(0 8μ),5 U/U1TaqPNA聚合酶(0. 3u1),其余用重蒸馏水补足。PCR反应条件:预变性95 C 5min,变性95 C30 s,退火温度(57~60 C)1 min,72 C延伸1 min,共35 个循环后,最后72 C再次延伸2 min,4 C保存。PCR扩增产物对照的检测:取护增产物3 ul, Pg(ATCC 33277)、Aa(ATCC 29523). Tf (ATCC 43037). Fn(ATCC 25586). Pi(ATCC 2561 1)标准株做阳性对照,不加任何模板的反应体系为空白对照。2g/L琼脂糖(含0. 5 mg/L溴乙锭)凝胶电泳,电压100V,以pUC19DNA /Mgl、DNA M arker DL2000为标准对照，紫外线检测仪观察扩增条带。

1 7数据处理用SPSS 11. 5统计软件,计量材料以x士表示，两样本之间均数比较用i检验;组间比较用方差分析。P<0 05为差别有统计学意义。

2结果

376例牙周病患者龈下菌斑中5种牙周炎相关致病菌的PCR法和培养法的总检出率分别为Pg40.96% (154/376). 1782% (67/376), Tf88 56%(333/376)、27. 66% ( 104/376)， Fn 81. 91%(3081376).23. 67% (89/376), Pi 57. 98% (2181376)、19. 15% (72/376)，PCR法检出率均高于培养:法(P <0 01);Aa 19. 15% (72/376)、9 31% (35/ 376), PCR法检出率虽高于培养法但无统计学意义(P>0.05)。儿童组与成人组两种方法各自的检出率见表1.

3讨论

牙周炎的发病机制是近年来的研究热点，目前研究着重于包括Pg.Aa. Tf Fn. Pi等牙周炎可疑致病菌。由于该菌群属于难以培养的厌氧螺旋菌,其分离鉴定程序十分繁琐,很长时间一直没有受到应有的关注。近年来PCR和基因序列分析技术的发展应用,使得对牙周致病菌的研究摆脱了传统培养法的限制。16SrRNA 基因克隆技术通过扩增各种细菌共有基因序列片段，分析代表不同菌种的克隆子的数量计算各种细菌的相对数量,具有培养方法难以比拟的优势”。本实验结果显示,除Aa外,培养法的阳性检出率明显低于PCR法(P<0. 01)，这是由于牙周炎相关致病菌的培养时间长条件要求高，需要在严格持续的厌氧环境下操作,存在人为误差的机率大,而PCR 技术检测的是标本内螺旋菌的DNA,有方法快速、敏感性高等优点。

本实验中检出率最高的是福赛斯坦纳菌(Tf)(88 56%,27. 66% )和具核酸杆菌(Fn) (81 91%，23. 67%)。Tf主要的外膜蛋白基因为pA基因,此基因由419bp可读区与类似细菌脂蛋白的信号肽组成。Tf外膜成分通过粘附,定植于宿主组织起细胞毒作用。Tf还可以抑制T淋巴细胞增殖和中性粒细胞产生过氧化物。导致宿主抗菌能力下降。Fn是口腔感染部位的优势菌,在与Pg. Tf Aa链球菌等的混合感染中起协同作用。有学者认为Tf和Fn在慢性牙周炎中起主要作用，并且与早发性牙周炎急性坏死性牙龈炎以及各种严重牙周损害的破坏性牙周病密切相关，,其检测到的概率以及数量的多少可用作观察牙周疾病严重程度及监测治疗效果的指标”]。

本实验中各菌在儿童组的检出率均低于成人组,提示儿童患者慢性牙周炎的发病和进展可能与其特定的牙周结构和其他细菌感染有关，这有待进一步研究。

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