PCR法检测龈下菌斑中致病菌群分布的实验研究

傅尧",符义富",游丽萍*,曾以周”,周炳荣”,杨卫 东°

(南京大学医学院附属口腔医院a.检验科;b.外科;c.内科,南京210008)

摘要:目的建立牙周致病菌的 16S rRNA序列分析方法,讨论洁悠神长效抗菌材料对牙周病患者龈下菌斑的作用及牙周致病菌的分布。方法对376 位牙周病患者(咸年组306例、儿童组70例)在洁悠神长效抗菌材料用药前、后龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌(Pg)、伴放线嗜血杆菌(Aa)、福賽斯坦纳菌(Tf)、具核梭杆菌(Fn)、中间普氏菌(Pi)5种牙周炎相关致病茵分别进行培养法和16S rRNA序列分析技术检测。结果PCR 法和培养法的检出率分别为Pg(40. 96%.17. 82%),Tf(88. 56% ,27.66%),Fn(81.91% ,23.67%),Pi(57. 98% ,19.15%),Aa(19.15%,9.31%),除Aa(P>0. 05)差异无统计学意义外,后者栓出率明显低于前者(P<0.01),儿童组的检出率明显低于成人组(P<0.05);用药后的PCR法和培养法检出率都明显低于用药前(P<0.05),差异有统计学意义。结论通过 16S rRNA序列分析技术对牙周病患者致病菌的分析,可以对目前技术.上能培养以及无法培养的牙周菌进行分类,对防治牙周感染具有一定的指导作用。

关键词:16 SrRNA序列;牙周致病菌;厌氧菌;洁悠神长效抗菌材料

中图分类号:R781.4;Q503文献标志码:A 文章 编号:1671-7414(2009)03-115-03

doi:10.3969/j. issn. 1671-7414. 2009.03.045.

牙周疾病是由细菌感染引起的,牙龈卟啉单胞菌(Pg)、伴放线嗜血杆菌(Aa).福赛斯坦纳菌(Tf)、具核梭杆菌(Fn)、中间普氏菌(Pi)是其重要的致病菌。流行病学研究显示20%~50%的牙周致病菌为螺旋体[,龈下菌斑中的微生物及其代射产物是引发牙周炎的始动因子,在以往的牙周病原菌的研究中,由于其分离鉴定比较困难,牙周炎相关致病菌很长时间一直难以检测;本研究使用16SrRNA序列分析技术检测牙周病患者龈下菌斑细菌的变化,了解其分布趋势,并与培养法相比较,旨在探求一种适合于临床的、敏感快速的牙周菌斑检

测方法,为临床防治感染提供参考。

1材料与方 法

1.1 临床资料

2005年8月~2007年8月在本院门诊治疗的376位患者,所有患者均经本院牙周科医生确诊为慢性牙周炎(CP),均愿接受洁悠神物理抗菌喷雾敷料治疗,分为两组:成年组:306例,男性152例,女性154例,年龄35~60岁;儿童组:70例,男性36例,女性34例,年龄7~12岁。

1.2 主要试剂及设备洁悠神长效抗菌材料(南京神奇科技开发有限公司提供,规格30 ml/瓶,剂量为0.1 ml/次) ,GENbox anaer REF124厌氧培养箱(法国梅里埃公司),REF124厌氧产气袋(批号: 24B05-12)、REF 96 118 厌氧指示器(批号:08904B)购自德国Merck KGaA公司,BSK培养基(英国Oxoid公司), Chelex-100 (Sigma公司), PCR试剂盒.蛋白酶K液(上海生工公司), PCR扩增仪(PTC-200),紫外分光光度仪(Genequantpro公司)。

1.3标本的采集龈下菌斑标本均由本院牙周科医生收集。先用无菌生理盐水冲洗每例患者的病变位点三遍,再用无菌眼上、下刮治器去除取样牙齿上的菌班,一份立即放入灭菌后肉汤培养的RTF 管中,加无菌液体石蜡封闭;一份放人无菌Eppen-dorf管中,一70'C保存。用药方法:在第一次标本采集病变位点部面(缘)喷涂洁悠神长效抗菌材料,剂量为0.1 ml/次,每日3次.采样时间为每例患者用药前及用药后第2 d。

1.4 细菌培养和初步鉴定 将RTF管中的标本用振荡器混勻60 s,采用硫乙醇酸盐稀释,选择稀释度为10~*的浓度，接种至BSK平板培养基中,再将BSK培养基放在厌氧培养箱内培养7 d (BSK培养基在使用前于N2: H:=0.95; 0. 05环境中预还原24~48 h)。按Bergery系统细菌鉴定标准，根話菌落特征挑选单个菌落涂片做革兰染色和初步生化鉴定。

1.5 PCR引物、方法及细菌DNA的提取

1.5.1 PCR 引物设计与合成:5种牙周致病菌的16S rRNA特异性引物序列设计参照文献[~J].上、下游引物的核苷酸序列5'→3' ,PCR扩增片段长度及退火温度分别是:齦下菌斑中牙龈卟啉单胞菌(Pg) TGTAGATGACTGATGGTGAAAACC和ACGTCATCCACACCTTCCTCE, 131bp, 58C;伴放线嗜血杆菌(Aa) GCTAATACCGCGTAGAGTCGT和ATTTCACACCTCACTTAAAGGT叫, 235bp, 59.5C;福赛斯坦纳菌(Tf) GTCG-GACTAATACCTCATAAAACA和TCGCCCATTGACCAATATT,419bp,59.5℃;具核梭杆菌 Fn ) GGCCACAAGGGGACTGAGACA 和TT-TAGccGu氏菌(Pi) GTGcTTGCAAGcccGGACGTCGAC和CGTCTGCAATTCAAGCCCGGGYAAG[,367 bp,57℃.

1.5.2细菌DNA的提取及PCR的方法:参照文献°,在含有牙周致病菌斑块的Ep管中加人20mg/ml蛋白酶K液4pal和5%Chelex-100液150ul ,振荡10 min混匀,取上清液一20℃保存。PCRMgCl: 1pzl,Buffer缓冲液2 l. 1o mmol/ paldDNTP o. 4 ul. 10 pmol/rl 1E金用双蒸水补5U/pl TaqDNA聚合酶0.3 pal,其余用双蒸水补足。PCR反应条件;预变性95℃ 5 min,变性95℃30 s,退火温度(57~60℃) 1 min,延伸至72℃1min,共 35个循环,最后72℃再次延伸2 min,4℃保存.设置对照及PCR扩增产物的检测:取扩增产物3 pal.Pg(ATCC33277),Aa(ATCC29523),Tf( ATCC43037 ).Fn ( ATCC25586 )，Pi(ATCC25611)标准株做阳性对照,不加任何模板的反应体系为空白对照。2 g/dl 琼脂糖(0.5 mgEB/L)凝胶电泳,电压100V.以 pUC19DNA/Mspl,DNA Marker DL 2000为标准对照,紫外线检测仪观察扩增带。

1.6数据处理采用PEMS 统计软件,计量资料以宝士s表示,两样本之间均数比较用e检验;组间比较用方差分析。P<0.05为差别有统计学意义。

结果

2.1洁悠神物理抗菌喷雾敷料处理前后龈下菌斑微生物检出结果(宝士s,lg CFU/ml)用药前(n=376),需氧菌和厌氧菌分别为64.3士6.1,33.1士3.6;用药后(n= 376),需氧菌和厌氧菌分别为39.8士6.4,10.1士4.4。结果显示,在使用洁悠神物理抗菌喷雾整料处理后无论是需氧阳还是厌氧差异都有统计学显著性意义(=21.82rt,= 32.19,P值均<0.05),均表现为用药后的菌落数明显减少。

2.2儿童组与咸年组两种方法的检出率见表1。376例牙周病患者龈下菌斑中5种牙周炎相关致病菌PCR 法和培养法的总检出率分别为Pg(4o.96%.17.82%,Tf( 88.56.2?.66rn(81.91%,23.67%), Pi ( 57.98%,19.15%),Aa(19.15%,9.31%),均表现为PCR法阳性检出率高于培养法,除Aa(P>0.05)外,其余4种牙周炎相关致病菌Р值均≤0.01,儿童组的检出率明显低于成人组(P<0.05).

3讨论牙周炎的发病机制是近年来的研究热点,目前研究主要着重于包括牙龈叶琳单胞菌( Prophromonas gingivalis ,Pg)、伴放线嗜血杆菌(Actineobacilles actinormycetemecomitans.Aa和静梦斯坦纳菌《Tannerella forsythia ,Tf)等牙周可疑致病菌。在以往的牙周病原菌的研究中,由于难以培养,螺旋体很长时间一直没有受到应有的关注,近年来,聚合酶链和基因序列分析技术的发展应用，使得对牙周致病菌的研究摆脱了传统实验室培养的限制,16S rRNA 基因克隆技术通过扩增各种细菌共有基因序列片段,分析标本中的菌群结构,对实验室难以培养的细菌具有相同的检测效率,通过代表不同细菌种类的克隆子的毂第订界兹行细的相对数量,具有培养方法难以比拟的优势[。

本研究中PCP法和培养法检出率最西的是Tf(88.56%.27.66%和Fnc81.91o23J比由iTf主要的外膜蛋白基因为pA基因:此基团i419 bp 可读区与类似细菌脂蛋白的信号肢组脱工其外膜成分通过黏附,定植于宿主组织起细胞毒作用,Tf还可以抑制工淋巴细胞的增里相中在社中胞产生过氧化物,导致宿主抗菌能力下:n垄以腔感染部位的优势菌,可与PgTf.Aa ,链球菌等混合感染中起协同作用。有学者认为Tf和Fn在牙周炎的慢性感染中起主要作用,并且与早发性牙周炎、急性坏死性牙龈炎,以及各种严重牙周损害的破坏性牙周病密切相关,其检测到的概率以及数量的多少可用作观察牙周疾病严重程度及监测治疗效果的指标·。

本课题组前期研究已证实:洁悠神物理抗菌喷雾敷料对口腔癌瘤术后菌群具有抑制作用0。本研究表明该敷料对牙周炎相关致病菌群同样具有明显的抑制作用并影响其分布,这是由于洁悠神敷料是高分子活性剂,其结构为“胶联层”和“正电荷层”复式叠加,能够在皮肤或黏膜表面敷着固化,形成分子级隐形抗菌敷料,因此独具长时效抗菌性，达到物理抗菌作用[101。另外儿童组的检出率明显低于成人组的检出率,提示儿童患者中牙周炎的发病和进展可能有其特定的组织结构和细菌学病因,这有待进一步研究。

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