“皮肤物理抗菌膜”专利技术在小鼠生殖道

淋病奈瑟球菌感染中的预防作用

方先林 戴玉田 尹跃平 兰厚金 周六化

【摘要】目的 探讨“皮肤物理抗菌膜”专利技术在小鼠淋病奈瑟球菌（简称淋球菌）感染中的 预防作用，以寻求淋病预防新方法。方法（1）模拟雄鼠向雌鼠传播淋球菌:将淋球菌WH0-L菌株 接种于经过苯甲酸雌二醇预处理的雌性BALB/c小鼠阴道。实验组小鼠阴道使用“皮肤物理抗菌膜” 长效抗菌材料，对照组小鼠阴道使用去离子水。接种后第2、4、5天取阴道分泌物做淋球菌培养，比较 两组检出率;接种后2〜10 d监测小鼠阴道分泌物涂片染色中多形核白细胞（PMN）平均数占总细胞 百分数。（2）模拟雌鼠向雄鼠传播淋球菌:用玻璃棒代替小鼠阴茎，与已感染淋球菌的雌鼠模拟性 交：实验组玻璃棒用长效抗菌材料浸泡，对照组用去离子水。洗脱玻璃棒头部分泌物,做淋球菌分离 培养，比较两组检出率。结果（1）模拟雄鼠向雌鼠传播淋球菌实验中，实验组淋球菌培养阳性率低 于对照组（第4天:10. 0%比57. 5% ；第5天：7.5%比45. 0% ,均F < 0. 01）；实验组小鼠在接种后 5〜8 dPMN百分比显著低于对照组（均FC0.05）。（2）模拟雌鼠向雄鼠传播淋球菌实验中，第1、2 天实验组玻璃棒头部分泌物淋球菌培养阳性率分别为8. 3%和0,显著低于对照组（72. 7%和45.5%, 有F〈0.01）。结论 长效抗菌材料通过形成物理抗菌膜，可以预防雌性小鼠生殖道淋球菌的感染或 定植，同时能对雄性小鼠能起到液态安全套的作用。

【关键词】奈瑟球菌,淋病；材料试验；长效抗菌材料

Prevention of Neisseria gonorrhoeae genital tract infection with patented technology of physical antimicrobial dermal film in a murine model FANG Xian-lin * , DAI Yu-tian, YIN Yue-ping, LAN Hou- jin, ZHOU Liu-hua. * Department of Urology, Affiliated Gulou Hospital, Medical College of Nanjing University, Nanjing 210008, China

Corresponding author： DAI Yu-tian, Department of Urology, Affiliated Gulou Hospital, Medical College of Nanjing University, Nanjing 210008, China, Email ：ytdai@ hotmaiL com

[Abstract ] Objective To explore a new method of preventing Neisseria gonorrhea （ N. gonorrhoeae） by simulating intercourse in mice and verify the effect of a long-acting antibacterial material in the gonococcal infection in mice. Methods （ 1 ） Simulated male-female gonococcal transmission: the estradio-treated BALB/c female mice were inoculated with N. gonorrhoeae WHO-L via a vaginal route. In treated group, the mice received the long-acting antibacterial material via vaginal route while deionized water was administered in the control group. At Days 2-10 post-inoculation, the average number of polymorphonuclear cells （ PMNs） was monitored in stained smears of vaginal cells from test mice. And the vaginal fluid was cultured for N. gonorrhoeae at Days 2, 4, 5 post-inoculation. N. gonorrhoeae genital tract infection was determined to compare the difference between the two groups. （2） Simulated female-male gonococcal transmission: a treated or sham glass rod was used instead of male mice^, s penis to simulate intercourse in gonococcus-infected female mice. The vaginal fluid on top of glass top was eluted and cultured for N. gonorrhoeae and the difference of relevance ratios compared. Results （ 1 ） In the experiment of simulated male-female gonococcal transmission, At Days 4 and 5, the positive rates of culture for N. gonorrhoeae of the tested group were lower than those of the control group, and there was significant difference between both groups （10. 0% vs 57. 5% , 7. 5% vs 45. 0% , both P < 0. 01）. The percentage of PMNs in the treated group was significantly lower than that of the control group at Days 5-8 post-inoculation （all P <0. 05）. （2） Tn the experiment of simulated female-male gonococcal transmission, the positive rates of culture for N. gonorrhoeae from the vaginal fluid on top of glass top were 8. 3% and 0 at Days 1 and 2 in

DOI： 10.3760/cma. j. issn. 0376-2491.2011.06.011

作者单位：210008南京大学医学院附属鼓楼医院泌尿外科（方先林、戴玉田、兰厚金、周六化）；中国医学科学院 皮肤性病研究所微生物实验室（尹跃平）

通信作者:戴玉田，Email: ytdai@ hotmaiL com

the tested group respectively. And they were significantly lower than those of the control group (72. 7% and 45. 5% respectively, both P < 0. 01). Conclusion After topical application in murine vagina, the long- acting antibacterial material forms a layer of physically antibacterial molecular film to prevent the occurrence of N. gonorrhoeae genital tract infection or colonization in mice. It may be used as a liquid condom for male mice.

[Key words 】 Neisseria gonorrhoeae ； Materials testing ； Long-acting antibacterial material

淋病是世界范围内发病率较高的性传播疾病之

一。安全套是预防淋病的主要方式。随着“皮肤物 理抗菌膜”技术的问世，为淋病的预防提供了一种 新的途径。本研究通过构建淋病奈瑟球菌（简称淋 球菌）小鼠实验动物模型，模拟淋病性交传播方式， 观察使用“皮肤物理抗菌膜”对小鼠淋球菌感染率 的影响。

一、材料与方法

1. 菌株和实验动物:淋球菌标准株WH0-L,由 中国医学科学院皮肤性病研究所尹跃平博士惠赠。 清洁级BALB/c雌性小鼠（6 - 8周）80只， 20 -22 g,购自南京医科大学动物中心［SCXK（苏） 2005002］。

2. 材料和试剂:苯甲酸雌二醇（油针剂,1 mg/ml）, 天津金耀有限公司。Thayer-Martin （ T-M）培养基。 2% “洁悠神”长效抗菌材料（主要成分为有机硅季 铉盐），南京神奇科技公司。

3. 实验小鼠的雌激素预处理⑴：所有小鼠均饲 养在无菌隔离饲养笼内，水和食物都进行了无菌处 理。预处理前用自制的阴道拭子取小鼠阴道脱落上 皮细胞涂于洁净玻璃片上，瑞氏染色后，镜下观察细 胞形态。确认小鼠处于发情间期（有较多的有核上 皮细胞及中性粒细胞）。每只小鼠经腹部皮下注射 1 mg/ml的苯甲酸雌二醇0. 1 ml,每2天注射1次， 共6次。淋球菌接种前2 d,用万古霉素盐酸盐0.8 mg/只、链霉素盐酸盐1-2 mg/只腹腔内注射，2 次/d,以抑制小鼠阴道共生菌的生长。

4. 淋球菌菌液的制备:收获在T-M淋球菌培养 基上培养20 ~24 h的淋球菌（标准株），混悬于含有 0. 5% mmol/L CaCl₂ ^1 mmol/L MgCl₂ 和 1% 明胶的 磷酸盐缓冲液（PBS）中，充分混匀,微孔滤膜过滤。 配制Me Farland比浊液，用比对法调整菌液至3 X 10⁸CFU/ml_o

5. 模拟雄鼠向雌鼠性交传播淋球菌实验:门：将 已用雌激素处理后的雌鼠分2组:实验组和对照组 （每组40只）。实验前2 h分别用5 mmol/L HEPES 50 |il清洗阴道。实验组小鼠在阴道内用接种枪滴 入10 |jl12%有机硅季铉盐;对照组小鼠阴道内滴入 10皿去离子水。分别在阴道内静置30 min,使有机 硅季铉盐及去离子水充分与小鼠阴道壁接触。用玻 璃棒代替小鼠阴茎,玻璃棒头部分次沾取10 |xl淋 球菌混悬液，玻璃棒头部分别在2组小鼠阴道内反 复抽送5 min,使菌液与阴道壁充分接触后退出玻璃 棒。在性交实验后第2、4、5天用阴道拭子分别取阴 道分泌物，样本溶于100 |il PBS液中，涂布于T-M 培养基上，在36龙，5% ~ 10% C0₂条件下烛缸培 养24 h₀观察有无淋球菌生长，可疑者对细菌菌落 做革兰染色,氧化酶实验。于接种后2 ~10 d通过 监测阴道分泌物中多形核白细胞（PMN）平均数百 分比来反映局部炎症变化。

6. 模拟雌鼠向雄鼠性交传播淋球菌实验:将模 拟雄鼠向雌鼠性交传播淋球菌实验中的对照组中第 4天淋球菌培养阳性小鼠作为模型动物，随机（完全 随机抽样）分成2组:实验组（几=12）；对照组（口 = 11）,并记为感染后。d。实验时分别于感染后1、 2d进行模拟性交实验。具体操作为:用玻璃棒代替 阴茎;实验组玻璃棒头部使用2%有机硅季铉盐浸 泡;对照组用去离子水浸泡。于感染后第1、2天，分 别用玻璃棒头部在阴道内反复抽送5 min后，退出 玻璃棒。用PBS液洗脱玻璃棒头部分泌物,按上法 进行淋球菌培养，比较淋球菌检出率的差异。

7. 统计学处理：用SPSS 11.5软件，两组间 PMN百分比数据采用Student t检验,两组间淋球菌 培养阳性率数据采用X²检验。

二、结果

1. 雌激素对小鼠阴道上皮细胞的影响：注射雌 激素后阴道涂片检查可见2组小鼠均处于发情期, 镜下特征为:大量不规则、折叠卷曲、核消失的角化 上皮细胞比例增高（占所有上皮细胞总数的90% ~ 95% ），见图 1。

2. 模拟雄鼠向雌鼠性交传播淋球菌实验结果: 在淋球菌攻击后第2天,2组淋球菌培养均为阴性; 第4、5天实验组淋球菌培养阳性率分别为10.0% （4/40）和7.5% （ 3/40 ）,对照组阳性率分别为 57. 5% （23/40）和 45. 0% （18/40），实验组淋球菌培 养阳性率均显著低于对照组（x² = 19. 654,14. 528,
均P<0.01）_o淋球菌攻击后第4天可见PMN细胞 吞噬淋球菌反应（图2）；第5 ~8天，对照组中PMN 百分比均高于实验组（均F < 0. 05 ,图3）。PMN平 均数百分比持续升高2 d即可认为产生炎症。

图1接种前发情期小鼠阴道分泌物涂片瑞氏 X100 图2接种淋球菌后第4天小鼠阴道分泌物涂片革兰x 1000箭头处为PMN胞质内淋球菌

50

45

40

35

30

25

20

15

10

5

0 ..

图3两组小鼠阴道分泌物中多形核白细胞（PMN）平均数 百分比比较

3. 模拟雌鼠向雄鼠性交传播淋球菌实验结果: 第1、2天实验组玻璃棒头部分泌物淋球菌培养阳性 率分别为8. 3% （1/12）和0（0/12）,对照组阳性率 分别为72. 7% （8/11）和45. 5% （5/11）,实验组阳 性率显著低于对照组（均P <0.01）_o

三、讨论

女性淋病患者易发生一系列不良后果,包括盆 腔炎、不育、异位妊娠、流产、新生儿眼炎和失明等; 此外,淋病显著增强了人类免疫缺陷病毒（HIV）的 传播⑵。淋球菌主要感染下生殖道黏膜的上皮细 胞及少部分的直肠、口咽和结膜黏膜上皮细胞;该病 的传播依赖于：（1）接触部位：①女性传给男性: 20% -30%是通过单一的性交接触;②男性传给女 性：60% -80%是通过单一的性交接触（在阴道内 射精导致感染）；（2）接触的次数。淋病的潜伏期在 2~7 d,少数男性感染者无症状，而大部分女性患者 不表现出症状。据美国疾病预防控制中心（CDC） 估计每年在美国有超过70万新淋病感染者,但是只 有一半被报告至CDC,因为其中有大部分感染者属 无症状或未被检测出来的隐性感染者"可。这些隐 性感染者的存在给淋病的防治工作带来了巨大的挑 战，同时伴随着不断出现的新的耐药菌株，增加了淋 病的发病率，影响到淋病的控制策略⑵。

用雌激素处理的小鼠模型是惟一的小动物生殖 道淋球菌感染模型。Song等⑸研究表明淋球菌可 侵入小鼠生殖道深层组织，如固有膜,感染部位主要 为阴道上部及宫颈部。这说明经雌激素处理的小鼠 生殖道感染模型,更倾向于下生殖道感染模型，而不 是阴道定植模型。关于雌激素可增加小鼠生殖道对 淋球菌的易感性的机制目前仍不清楚。可以肯定的 是在小鼠发情周期的早期阶段，当雌激素水平较高， 阴道共栖菌较低时可表现出对淋球菌的短暂易感 性。通过给予外源性的雌激素，小鼠无菌化处理，或 者通过使用抗生素抑制阴道共栖菌的生长等手段可 以延长淋球菌在小鼠生殖道的定植和感染，从而获 得相对较为稳定的小鼠生殖道淋球菌感染模型;用 小鼠来模拟人类淋球菌感染,是基于雌性小鼠和女 性的下生殖道在生理学上的一些相似性1岡。

目前我国研制的新型“皮肤物理抗菌膜”专利 技术,即“洁悠神”长效抗菌喷雾剂作为一种高分子 活性剂,其水溶性制剂喷洒在皮肤、黏膜表面形成一 层致密的正电荷网状膜;对带负电荷的细菌、真菌、 病毒等病原微生物具有强力吸附作用,通过静电力 作用达到杀灭或抑制病原微生物，不会产生耐药性。 本研究中淋球菌攻击后5 ~8 d,实验组雌性小鼠 PMN平均数百分比显著低于对照组,对阴道拭子分 离培养的结果发现，在模拟性交后第4、5天,实验组 淋球菌培养阳性率低于对照组，说明实验组雌性小 鼠没有产生生殖道感染。另外在模拟雄鼠向雌鼠性 交传播淋球菌的实验中，实验组玻璃棒头部分泌物 淋球菌培养阳性率显著低于对照组，说明“皮肤物 理抗菌膜”能显著降低其头部携带的淋球菌。通过 上述两个模拟实验均证明了 “皮肤物理抗菌膜”在 预防小鼠淋球菌感染中有效，能起到液态安全套的 作用。但能否应用于女性淋病的防治，需要进一步 的临床实验证实。

本实验的缺点是小鼠淋球菌感染模型不够稳 定,感染时间较短，这使得其应用受到限制。随着转 基因小鼠的应用,解决宿主限制性问题，这些问题有 望得到解决。

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